IDT NGS二代測序文庫均一化試劑盒

--獲得高度穩定且均一化處理的DNA/RNA測序文庫

北京云肽生物科技代理的美國進口IDT xGen Normalase 文庫均一化試劑盒，采用了一種新型酶促文庫均一化處理技術，可對|||umina測序儀測序前的DNA或RNA文庫進行均一化處理。通過IDT文庫均一化試劑盒，上機前無需進行單個文庫濃度檢測，可得到優化的簇密度和更均衡的文庫。IDT文庫均一化處理試劑盒可搭配常規建庫實驗流程，不僅能縮短實驗整體的操作時間，還能提高NGS文庫上機濃度的精確性，實現混合文庫間測序數據量的均一性。IDT文庫均一化處理實驗流程包括文庫的非偏好件選擇、酶均一化反應，在文庫擴增中使用帶有Normalase標記的引物，可穩定得到3倍于目標均一化濃度的產量。例如上機前文庫濃度需要均一化為2nM或4nM的標準文庫產量，則IDT均一化反應前文庫濃度至少分別為6nM或12M(20ul體積)。該實驗過程中不需要增加額外PCR步驟，僅需將常規文庫擴增引物替換成帶有Normalase標記的測序通用引物或帶有樣本標簽的引物。IDTxGen Normalase 文庫均一化試劑盒為高通量實驗室提供了快速、可擴展的文庫標準化工作流程。

優勢

①節省時間，提高通量：統一的樣本處理過程，生成平衡均一的混合文庫；

②減少文庫測序差異，降低測序費用：得到更平衡的混合文庫，允許更多的樣本混合上機，降低測序成本；

③適用多種工作流程，設計靈活：兼容多種文庫制備方法，獲得均一平衡的測序數據。

圖.IDT xGen Normalase 文庫均一化試劑盒的工作流程始于建庫接頭連接反應后，工作流程根據使用全長或短接頭而不同。通過NormalasePCR，將文庫擴增到均一化處理反應所需zui低數量，然后進行下游的酶均一化處理。在此過程中，如連按反應中使用全長接頭，PCR擴增需使用帶有Nomalase標記的測序通用引物;如使用非全長接頭，則需使用帶有Normalase標記的樣本標簽作為擴增引物。將擴增好的單個NGS文庫分別進行15分鐘Normalasel孵育，此反應過程使用酶促法，可以無偏好性地選擇指定摩爾濃度的NGS文庫。之后，將每個文庫等體積的混合到一管中，進行15分鐘Normalase ll孵育，酶促法將每個NGS文庫標準化到指定的摩爾濃度。實現上機測序前，得到平衡且均一化的NGS混合文庫。

一

表.使用lDT Normalase試劑盒將文庫均一化處理成4nM，上樣濃度為12pM，得到和預期一致的簇密度(lllumina MiSeq測序，V2版本試劑)。

二、相比傳統上機定量方式，可得到數據量更均一的混合文庫

圖、測試分別來自于兩名實驗者(n=16/每名實驗者)的32個樣品，使用IDT xGen DNA Library PrepEZ 試劑盒構建文庫。實驗樣本為NA12878 gDNA，起始量為1~250ng。NormalasePCR后的文庫使用qPCR方法定量，保證文庫達到Normalase反應所需zui低閾值。"qPCR":基于qPCR定量結果，對文庫進行均一化處理、混樣和測序;"Normalase":同樣樣品使用Normalase試劑盒，對文庫進行混樣、均一化處理和測序。比較兩種方法每種接頭測序產生數據百分比(lllumina Miseq v2的50循環測序試劑盒)。結果顯示:qPCR混含文庫中文庫測序數量變異系數(CV)為22.5%，而Normalase混合文庫池的變異系數為9.4%(中位線為95%的置信區間)。

圖.10ngNA12878 gDNA，使用IDT xGen DNA Library Prep EZ試劑盒構建96個文庫，搭配IDT xGen CDl接頭引物進行擴增。文庫混樣、均一化處理前，使用Qubit定量結果做等體積的文庫混樣，之后使用lllumina Miseq V2測序試劑盒上機測序(50個循環)，通過每種接頭產生測序數據量百分比進行比較。均一化反應之前混合文庫池CV為15.5%，證明Normalase引物的擴增結果穩定、重復性好。將相同的文庫均一化處理到4nM，并使用lllumina Miseq V250循環測序試劑盒上機測序。均一化處理后，文庫CV降為7.7%，證明通過IDT xGen Normalase可得到更加均一化的混合文庫(中位線為95%置信區間)。

圖.針對不同GC%含量基因組細菌的測序覆蓋度及冗余率結果

使用IDT xGen DNALibrary Prep EZ建庫試劑盒，起始量為100ng DNA，包含三種不同比例混合的參考菌株(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈酶球菌)。片段化DNA至350bp，建庫時搭配全長的Y型接頭進行連接，使用Normalase標記的通用測序引物擴增3、5或7個循環。依據qPCR定量結果進行文庫混合，并使用lllumina MiSeq PE150測序。測序結果顯示，不同GC%含量基因組細菌的測序覆蓋度及冗余率沒有顯著差異。

圖.使用IDT文庫均一化試劑盒，對插入片段大小即菌種覆蓋度評估無影響

將5ng的MSA-1000樣品(GC%基因組含量不同的10種等比例混合菌株)，用IDT xGen DNA Lilbrary PrepEZ 試劑盒構建文庫，分別用IDT Normalase標記引物(紫紅色)和IDT普通引物(藍色)對兩個文庫進行擴增。使用IDT均一化試劑盒或Qubit將文庫均一化處理為4nM。進行lllumina MiniSeq 平臺高通量上機(PE-150)測序。實驗結果顯示，所構建的基因組文庫中(由不同GC%含量的細菌組成)，經IDT均一化處理的文庫，仍保持養穩定插入片段大小(A)和高基因組覆蓋度(B)。

三、文庫均一化試劑盒的使用，不影響原有RNA測序數據分析結果

平行對比RNA文庫進行上機前均一化處理使用IDT文庫均一化試劑盒(n=2)、GPCR方法(n=2)的效果。4個RNA-seq文庫(50ng人腦mRNA樣本)分別使用帶有Normalase標記的雙端樣本標簽、常規雙端樣本標簽進行文庫制備。將帶有常規樣本標簽的文庫(標記為"1"和"2"號文庫)，按qPCR定量結果進行文庫均一化及混樣。將帶有Nomalase標記的文庫(標記為"3"和“4號文庫)，在文庫制備完成后，搭配IDT文庫均一化試劑盒，將RNA文庫均一化處理至4nM，通過Miniseq(2x150)上機測序，證明IDT文庫均一化試劑盒對RNA-Seq分析結果無影響。將各文庫均一化處理至4nM后上機測序，使用STAR、Picard及RSeQC進行比對、進行RNA·sec數據分析。韋恩圖結果顯示，每個樣本中檢測到的qian一千個轉錄本結果沒有顯著差異。

表.相同RNA文庫，分別使用qPCR文庫定量、IDT Normalase文庫均一化試劑盒進行文庫均一化處理，其RNA·seq數據分析結果比較。由于IDT試劑盒使用非偏好性的酶促方法進行文庫均一化處理，因而兩種文庫均一化處理有著近似的RNA-seq分析結果，與預期相符。

表.相同RNA文庫，分別使用qPCR文庫定量、IDT Normalase文庫均一化試劑盒進行文庫均一化處理，其1000個高表達轉錄本分析結果比較。由于IDT試劑盒使用非偏好性的酶促方法進行文庫均一化處理，因而二者的1000個高表達轉錄本RNA-seq分析結果近似，與預期相符。

圖.韋恩圖顯示每個樣本中檢測到的qian一千個轉錄本結果沒有顯著差異

IDT文庫均一化試劑盒優勢

①可靈活調整均一化處理后文庫濃度，只需樣本擴增后濃度超過最少文庫量閾值，即可保證最終所需文庫濃度均一化;

②處理后的均一化文庫濃度為4nM，選擇使用≥6nM均一化工作流程時，最終文庫濃度為2nM;

③混合文庫間測序變異系數系數≤10%;

④試劑盒兼容性強，可兼容全長測序接頭或短接頭的建庫流程;兼容非靶向富集的工作流程，制備的文庫可直接測序(如全基因組測序或全轉錄組測序);兼容雜交捕獲流程，即靶向富集完成后上機前的文庫均一化。需保證均一化反應前，有穩定的文庫產量(20μL反應體系中文庫摩爾濃度≥6nM或≥12nM)，以得到標準的2nM/4nM文庫量;

⑤兼容IDT xGen接頭、IDT xGen Normalase CDl引物、IDT xGen Normalase UDl引物;

⑥兼容IIlumina測序平臺，并可獲得一致的測序結果。

北京云肽生物科技代理的IDT文庫均一化試劑盒產品